ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ В ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МИКРОСПОРИДИЙ Тимофеев С. А.,Сендерский И. В.,Павлова О.А.,Долгих В.В.

Санкт-Петербургский государственный университет


Номер: 6-1
Год: 2014
Страницы: 104-107
Журнал: Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук

Ключевые слова

микроспоридии, паразито-хозяинные отношения, дрожжи, гетерологичная экспрессия, секреторные белки, microsporidia, host-parasite interactions, yeast, heterologous expression, secretory proteins

Просмотр статьи

⛔️ (обновите страницу, если статья не отобразилась)

Аннотация к статье

Предложен новый подход - использование дрожжевой клетки в качестве модели для изучения молекулярных основ паразито-хозяинных отношений облигатных внутриклеточных паразитов микроспоридий со своими хозяевами. Экспериментально подтверждена возможность применения разработанной методики для демонстрации секреции паразитом в клетку хозяина конкретных белковых молекул, способных вмешиваться в регуляторные пути и сигнальные каскады зараженной клетки.

Текст научной статьи

Микроспоридии - группа родственных грибам облигатных внутриклеточных эукариотических паразитов, освоивших чрезвычайно широкий круг хозяев, от протистов до млекопитающих. Крайняя степень специализации представителей этого таксона к внутриклеточному паразитизму, экономическая и медицинская значимость делает актуальным изучение их взаимоотношений с хозяином. На сегодняшний день, молекулярные основы воздействия микроспоридий на своих хозяев изучены крайне слабо. Во многом это связано с методическими трудностями работы с данными паразитами, т.к. микроспоридии не культивируются вне клетки хозяина [1]. Одним из механизмов воздействия внутриклеточных паразитов на своих хозяев является секреция белков, способных вмешиваться в регуляторные пути и сигнальные каскады зараженной клетки. Такие белковые факторы патогенности были описаны у представителей других групп внутриклеточных паразитов, таких как Apicomplexa и Kinetoplastida [2]. Для изучения подобных механизмов у микроспоридий мы предлагаем оригинальный подход - использование дрожжевой клетки в качестве модельной системы. Данный подход основывается на филогенетической близости микроспоридий и дрожжей [3;4], из чего можно предположить, что секреторный аппарат последних сможет правильно распознать N-концевой сигнальный пептид в составе белков паразита, ответственный за секрецию данных молекул. Таким образом, если встроить полноразмерные копии изучаемых генов в геном дрожжевых грибов и осуществить их экспрессию, секреция соответствующих белков в культуральную жидкость будет означать, что и в клетках паразита данный белок секретируется за пределы цитоплазматической мембраны. В качестве объекта изучения в данной работе была выбрана паразито-хозяинная система микроспоридия-насекомое: Paranosema locustae - Locusta migratoria. Геном данного вида микроспоридии был полностью расшифрован французскими коллегами, что позволило с помощью компьютерного анализа выявить белки потенциально способные воздействовать на клетку хозяина, т.е. обладающие N- концевым сигнальным пептидом, необходимым для секреции молекулы за пределы цитоплазматической мембраны паразита [5]. Среди обнаруженных последовательностей присутствовал ряд ферментов, таких как эстеразы или протеиназы, но наиболее интересной оказалась группа из нескольких десятков, так называемых обогащенных лейциновыми повторами белков или LRR белков. Эта уникальная группа отсутствует у других внутриклеточных паразитов и демонстрирует сходство аминокислотных последовательностей с протеикиназами, Ras-подобными ГТФазами и ингибиторами РНКаз бактерий и высших растений [5]. Поскольку перечисленные белки широко участвуют в передаче внутриклеточных сигналов, а секреторные сигнальные пептиды обнаруживаются только в составе LRR-белков микроспоридий, есть все основания полагать, что данная множественная группа генов является основным инструментом вмешательства паразита в сигнальные каскады и регуляторные процессы хозяина. Для экспериментального изучения с применением предложенной нами методики мы выбрали два LRR белка, соответствующие 204 и 515 открытой рамке считывания в геноме P. locustae, а также обладающую сигнальным секреторным пептидом протеазу. Последовательности, кодирующие данные белки были PCR амплифицированы, клонированы в составе вектора pPic3.5 и встроены в геном метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, в которых далее была осуществлена гетерологичная экспрессия белков паразита. Из дрожжевых клеток и культуральной среды, в которой осуществлялась экспрессия, были приготовлены белковые пробы, каждая из которых была проанализирована на предмет взаимодействия с ранее полученными антителами к изучаемым белкам с помощью иммуноблотинга. Полученные данные, представленные на рисунке 1, демонстрируют, что оба LRR белка P. locustae накапливаются как в дрожжевых клетках, так и в соответствующей культуральной среде. В то же время, протеаза обнаруживается только в клетках дрожжей. Секреция пептида микроспоридии дрожжевой клеткой, которую мы наблюдаем для обоих LRR белков, означает наличие таковой секреции и у самого паразита, т.к. тонкий процесс распознавания сигнальной последовательности не может происходить случайным образом. В то же время, отсутствие секреции в дрожжевой системе, которое мы наблюдаем для протеазы P. locustae, не может дать нам никаких данных о поведении данного белка у паразита. Это связано с тем, что причиной этого явления может быть как то, что белок изначально не является секреторным у микроспоридии, так и то, что секреторная система дрожжевой клетки не смогла распознать сигнальную последовательность другого, хоть и родственного организма. Рис. 1. Вестерн-блот анализ дрожжевых проб с антителами против белков P. locustae, демонстрирующий распознавание дрожжевой клеткой сигнальных секреторных последовательностей в составе двух LRR белков P. locustae. 1 - проба дрожжевых клеток до индукции экспрессии метанолом; 2 - проба дрожжевых клеток после индукции экспрессии; 3 - контрольная проба дрожжевых клеток (в которых была осуществлена экспрессия другого белка P. locustae); 4 - проба культуральной среды, 5 - контрольная проба культуральной среды. А - экспрессия LRR ORF 204 (42 кДа); B - экспрессия LRR ORF 515 (79 кДа); C - экспрессия протеазы (55кДа). Не смотря на прогресс, достигнутый в медицине и биологии, до сих пор остаются не решенными большое количество важных задач []. На основании представленных в этой статье экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что предложенный нами подход - использование дрожжевой клетки в качестве модельной системы, действительно может быть использован для изучения белковых факторов патогенности микроспоридий. В частности, данная методика позволяет выбрать из большого количества белков-кандидатов на участие в воздействии паразита на хозяина те ферменты, которые действительно секретируются микроспоридией в зараженную клетку и приступить к их дальнейшему функциональному анализу.

Научные конференции

 

(c) Архив публикаций научного журнала. Полное или частичное копирование материалов сайта возможно только с письменного разрешения администрации, а также с указанием прямой активной ссылки на источник.