АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К УСЛОВНО - ПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ И ЛАКТО - И БИФИДОБАКТЕРИЯМ Прокопенко К.М.,Кнышова Л.П.

Волгоградский государственный медицинский университет Минздрава России


Номер: 6-2
Год: 2015
Страницы: 148-152
Журнал: Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук

Ключевые слова

антагонистическая активность, пробиотики, лактобациллы, бифидобактерии, antagonistic activity, probiotics, lactobacilli, bifidobacteria

Просмотр статьи

⛔️ (обновите страницу, если статья не отобразилась)

Аннотация к статье

Одним из основных показателей качества пробиотических штаммов при выборе кандидатов для создания новых пробиотических препаратов является их антагонистическая активность, определяемая in vitro . Цель нашей работы заключалась в изучении различных вариации метода прямого совместного культивирования для оценки антагонистической активности культур пробиотиков. Исследования проводились на основе коммерческих лиофилизированных культур пробиотиков. На основе полученных данных, мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов является вариабельным признаком, связанным с конкретным штаммом УПМ, выделенным от пациента.

Текст научной статьи

Введение. Одной из важнейших проблем современного здравоохранения, которое встречается у 70-90% населения большинства стран мира, в том числе и в России, является нарушение микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (дисбактериоз). Поэтому для профилактики и коррекции дисбактериозов крайне перспективным и экономически выгодным является создание доступных пробиотических препаратов [1, 36; 5, 73]. Важнейшим критерием отбора пробиотических штаммов является изучение их антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам (УПМ), которая обеспечивает колонизационную резистентность ЖКТ [2, 65; 3, 73; 4, 50]. Антагонистическая активность лактобацилл и бифидобактерий в организме человека может быть обусловлена многими факторами: конкуренцией за рецепторы, выработкой биологически активных веществ, подавляющих УПМ, бактериоцинов и бактериоциноподобных веществ, лизоцима, молочной, уксусной и других кислот, перекиси водорода. Вопрос о реализации этих факторов антагонизма в организме человека остается нерешенным, т.к. эти механизмы не универсальны. Проблемой изучения антагонистической активности пробиотических штаммов является отсутствие универсальной стандартизированной методики. Ранее нами была проведена работа по изучению различных вариации метода отсроченного антагонизма и метода прямого совместного культивирования для оценки антагонистической активности культур пробиотиков. Цель: изучить различные вариации метода прямого совместного культивирования для оценки антагонистической активности пробиотиков пробиотиков штаммов бифидобактерий и лактобактерий. Материалы и методы исследования. Для оценки антагонистической активности пробиотических штаммов использовали различные вариации метода прямого совместного культивирования (капельная методика). Данную методику используют с целью оценки антагонистической активности УПМ. Тестировали антагонистическую активность десяти пробиотических культур, входящих в препараты: 1) «Лактобактерин» НПО «Микроген», Пермь (L.plantarum или L.fermentum); 2) «Лактобактерин» НПО «Имбио», Нижний Новгород (L.plantarum или L.fermentum); 3) «Лактобактерин» НПО «Иммунопрепарат», Уфа (L.plantarum или L.fermentum); 4) «Нормофлорин-Л» ООО «Бифилюкс», Москва (L.acidophilus); 5) йогурт «Актимель» (L.casei);6) «Бифидумбактерин сухой» «Микроген», Пермь; 7) «Бифидумбактерин» ЗАО «Экополис», Ковров (B.bifidum №1, 79, ЛВА-3); 8) «Бификол» ОАО «Биомед» имени Мечникова, Московская область (B.bifidum);9) «Нормофлорин-Б» ООО «Бифилюкс», Москва (B.longum, B.bifidum);10)«Бифиформ» «Ferrosan», Дания (B.longum). Все коммерческие лиофилизированные культуры пробиотиков предварительно оживляли путем трехкратного пассажа на жидкой среде Шедлератак, чтобы их концентрация составляла 109 КОЕ/мл. Для выделения чистой культуры бифидумбактериий из комбинированных препаратов «Бификол» и «Бифиформ» проводили высев с жидкой среды на селективный агар для бифидумбактерий (HiMedia, Индия). Результаты исследования. Обязательным условием для применения этого метода является способность обоих тестируемых микроорганизмов к росту на используемой питательной среде. Капельную методику применяли для оценки антагонизма пробиотических лактобацилл, так как, в отличие от бифидумбактерий, их можно выращивать в микроаэрофильных условиях, как и большинство УПМ. Для постановки опытов использовали пробиотические лактобактерии третьего пассажа с жидкой среды Шедлера в концентрации 109 КОЕ/мл. Тестировали по 20 штаммов Enterobacterspp., Klebsiellaspp., Citrobacterspp., S.aureus, «атипичной» E.coli и 10 штаммов P.aeruginosa. Все культуры предварительно выращивали в питательном бульоне 16-18 часов при 37°С. Суточную культуру пробиотика наносили на поверхность колумбийского агара бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносили каплю культуры тестируемого УПМ. Растекаясь, вторая капля затекала на пятно культуры пробиотика до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, возникают конкурирующие отношения культур. Свободные части пятен каждой культуры служили контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капель чашки инкубировали в в атмосфере обогащенной углекислым газом при 37°С. Чтобы исключить возможность влияния последовательности наслоения капель тест - штаммов УПМ и культур лактобацилл, каждый опыт ставили в двух вариантах, меняя очередность посева культур. Предварительный учет результатов проводили через 18-24 ч инкубации, окончательный - через 48 ч. Наличие антагонизма выявляли визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой. Антагонистическую активность пробиотических препаратов оценивали по числу подавляемых ими штаммов тестируемых микроорганизмов (в %). Методом совместного культивирования можно определить следующие варианты взаимодействия пробиотика с УПМ: 1) подавление УПМ, 2) угнетение роста пробиотика или 3) отсутствие взаимного влияния (см. табл.1). Из представленных данных видно, что в подавляющем большинстве случаев (402 - 73,1% из 550 тестов, проведенных капельной методикой) отсутствовало взаимное влияние пробиотика и УПМ. Подавление пробиотика условно-патогенными микроорганизмами отмечено в 9,4 %, а подавление условно-патогенных микроорганизмов пробиотиком в 17,5%. По-видимому, каждый штамм УПМ, выделенный при дисбактериозе в значимом количестве, нуждается в проверке антагонистических свойств в отношении штаммов пробиотиков. В противном случае применение пробиотиков становится неэффективным. Так, например, препараты лактобактерий были неэффективны в отношении штаммов Klebsiellaspp. в 55-100% тестов в зависимости от тестируемого препарата. В 5-20% тестов с разными биопрепаратами рост пробиотиков подавлялся штаммами Klebsiellaspp. Все штаммы Enterobacterspp. былиустойчивы к двум препаратам. Штаммы Citrobacterspp. были устойчивы к биопрепаратам в 50-90% случаев в зависимости от типа препарата. Штаммы «атипичной» E.coli были устойчивы к биопрепаратам в 50-100% случаев. Антагонистическую активность проявляли 20-35 % штаммов E.coli. Штаммы S.aureus проявляли резистентность к пробиотическим препаратам в 60-100% случаев. К трем из пяти пробиотиков были устойчивы все штаммы псевдомонад. Для количественной оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против УПМ применяли метод перевернутого агара. Пробиотические препараты лакто- и бифидумбактерий в концентрации 1х109 по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича в количестве 50 мкл засевали газоном на колумбийский агар. Предполагаемые антагонистические метаболиты пробиотиков диффундировали в толщу агара и в дальнейшем влияли на рост тест - культур. Инкубировали в анаэробных условиях при 37 °С 48 ч. Затем агар переворачивали с помощью стерильного деревянного шпателя и засевали тест - культуры УПМ с обратной стороны в концентрации 109 клеток/мл. Для простоты подсчета данную методику модифицировали, используя количественный посев УПМ мерной петлей по Gold. Инкубировали 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Для контроля штаммы УПМ высевали на колумбийский агар без пробиотиков по Gold. Тестировали 100 штаммов УПМ: Enterobacterspp. - 20 изолятов, Klebsiellaspp. - 20, Citrobacterspp. - 20, S.aureus - 20, «атипичные» штаммы E.coli- 20.Препараты бифидобактерий проявляли выраженную антагонистическую активность в отношении Klebsiellaspp. (60-100%) эффективности), «атипичной» E.coli и S.aureus (25-100%) эффективности). В отношении штаммов Enterobacterspp. и Citrobacterspp. эффективность различных препаратов бифидобактерий была нестабильной - от 0 до 100 %. Эффективность препаратов лактобактерий независимо от группы УПМ была существенно ниже - 0-45%. Чувствительными к воздействию пробиотиков признавали штаммы УПМ, подавляемые не менее чем на 1 порядок по сравнению с контролем. Уменьшение количества различных УПМ составило 1-9 lg. Мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов оценивали по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем: 1 степень - подавление на 1-2 lg, 2 степень - на 3-4 lg, 3 степень - на 5-9 lg (вплоть до полного подавления роста УПМ) (см. табл. 1). Таблица 1 Антагонизм пробиотиков и условно-патогенных микроорганизмов в отношении друг друга. Метод прямого совместного культивирования (капельная методика) Примечание: 1 - подавление УПМ пробиотиком; 2 - угнетение роста пробиотика; 3 - отсутствие взаимного влияния (УПМ был нечувствителен, но и не подавлял пробиотический штамм) Вывод. Мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов также является вариабельным признаком, степенью выраженности которого определяется не столько видом пробиотика, сколько особенностями его взаимодействием с конкретным штаммом УПМ, выделенным от пациента.

Научные конференции

 

(c) Архив публикаций научного журнала. Полное или частичное копирование материалов сайта возможно только с письменного разрешения администрации, а также с указанием прямой активной ссылки на источник.