СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ РНК Шевченко З.А.,Телегина Ю.В.,Лебедев Л.Р.

Новосибирский национальный исследовательский государственный университет


Номер: 8-2
Год: 2017
Страницы: 9-13
Журнал: Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук

Ключевые слова

двуспиральная РНК (дсРНК), индукторы интерферонов, double-stranded RNA (ds RNA), interferon inductor

Просмотр статьи

⛔️ (обновите страницу, если статья не отобразилась)

Аннотация к статье

С целью получения интерферон индуцирующих препаратов на основе РНК были исследованы параметры процесса лизиса клеток пекарских дрожжей и условия фракционирования нуклеиновых кислот. Показано, что без температурной обработки препараты РНК получаются более высокополимерными и содержат дополнительно двуспиральные формы с размерами в районе 1500 и 3200 пар оснований. Разработан способ очистки препаратов.

Текст научной статьи

Индукция биосинтеза эндогенных интерферонов при использовании препаратов на основе РНК во многом зависит от спиральности последних. Это обусловлено взаимодействием двуспиральных РНК (дсРНК) с ТLR-3 рецепторами на поверхности клеток и запуском сигнального пути для индукции экспрессии интерферонов 1 типа и стимуляции экспрессии провоспалительных цитокинов. Наибольшей активностью обладают препараты на основе двуспиральных РНК (дсРНК) Ридостин, Вестин, Ларифан [1]. Многие способы получения препаратов РНК из дрожжей включают в себя либо кипячение суспензии последних (10-40 мин при 92-98 0С) [2], (40 мин при 99-100°С) [3] при получении высокополимерной РНК, либо прогревание (75-90°С в течение 5-20 мин) при получении дсРНК [4]. Известно, что двойная спираль рибонуклеиновых кислот «плавится» и расплетается при температурах 68-75 0С. РНК в отличие от ДНК содержит вместо дезоксирибозы рибозу, которая имеет дополнительную гидроксигруппу, следовательно делает двухцепочечную структуру менее компактной и после «плавления» исходная структура РНК восстанавливается значительно хуже. Цель работы состояла в исследовании стадий лизиса клеток дрожжей и фракционирования РНК солями для разработки способа получения препаратов на основе РНК. Материалы и методы исследования Работу проводили с биомассой хлебопекарных прессованных дрожжей «Люкс экстра» (г. Курган, ООО «САФ_НЕВА», группа компаний «А COMPANY», ТУ 9182-038-48975583-2010). При исследованиях лизиса на 1 г клеток дрожжей добавляли по 2 мл буфера. В работе использовали реактивы: агароза, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), додецилсульфат натрия (SDS), бромистый этидий, («Sigma», США); хлороформ, N2HPO4, LiCl и NaCl квалификации «хч» отечественного производства, набор ДНК-маркеров 1 Kb («СибЭнзим», Россия). Состав препаратов оценивали методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Использовали верхнеприводную мешалку (Heidolph, Германия), частота оборотов 35-250 об/мин. Центрифугирование образцов проводили на центрифугах MiniSpin («Eppendorf», Германия), Microfuge 22R или J2-21 («Beckman Coulter», США). Результаты и обсуждение Проблемой при разрушении клеток дрожжей для извлечения РНК является то, что значительная часть высвобождающихся из клеток нуклеаз инактивируется при температурах 65-70 0С, тогда как двойные спирали рибонуклеиновых кислот «плавятся» и расплетаются при температурах 68-75 0С. Соблюсти температурные режимы, когда нуклеазы уже инактивируются, а дсРНК еще не расплетается, довольно сложно, особенно в больших объемах. Поэтому мы использовали низкотемпературный режим лизиса клеток, применяя ингибиторы нуклеаз (ЭДТА, SDS). Получение экстракта клеток. За основу взяли метод лизиса, предложенный в работе [5]. Биомассу дрожжей суспендировали в буфере (25 мМ N2HPO4, 50 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, рН 6,8), содержащем SDS в концентрации 2% и перемешивали при температуре 25 0С, затем добавляли хлороформ до 25% и продолжали перемешивать. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты, центрифугировали их (8000g - 15 мин), определяли в надосадочных фракциях оптическую плотность при длине волны 260 нм и анализировали содержимое методом электрофореза в геле агарозы (рис.1). Рис.1. Анализ динамики процесса лизиса клеток дрожжей: Слева - зависимость оптической плотности при длине 260 нм (о.е./мл) в надосадочных фракциях от времени лизиса, а - без внесения в суспензию хлороформа, б - с внесением (стрелкой показано внесение хлороформа). Справа - анализ надосадочных фракций электрофорезом в 1%-ом геле агарозы: 1 - 10, 2 - 20, 3 - 30, 4 - 45, 5 - 60 мин, внесение хлороформа и продолжение инкубации, 6 - 70, 7 - 80, 8 - 90 и 9 -120 мин. На рис.1 видно, что прирост оптической плотности (выход содержимого клеток в раствор) при перемешивании в буфере с SDS и ЭДТА выходит на плато в период 60 - 90 мин (график «а»). Эти данные сопоставимы с результатами работы [6] (90-120 мин при 200С). Выход из клеток основной массы нуклеиновых кислот, определенный электрофорезом в геле агарозы. наблюдается в этот же период (рис.1, справа). Внесение в суспензию на этой стадии лизиса хлороформа до 25% и перемешивание приводит к удалению из водной фракции липидов, дополнительной денатурации белков с переводом их в интерфазу при центрифугировании. Этим обусловлено снижение оптической плотности в водной фазе (график «б»), но нуклеиновые кислоты продолжают оставаться в растворе (рис.1, справа). На основании экспериментальных данных была определена последовательность процедур лизиса клеток дрожжей: суспендирование клеток в буфере, содержащем: 25 мМ N2HPO4, 50 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl и 2% SDS,, рН 6,8 при 250С и перемешивание 60 мин; добавление хлороформа до 25% и перемешивание 30 мин; центрифугирование (8000g, 20 мин при 40С); сбор водной фазы. Этим методом были проверены три вида сухих и три вида прессованных дрожжей с различных заводов (рис.2). Рис.2. Электрофореграмма (1,5%-ный гель агарзы) образцов экстрактов из клеток дрожжей: 1 - 3 сухие (1- ООО «Топ-Продукт» ТУ 9132-009-18457800-05; 2,3 - ООО «САФ-НЕВА» ТУ 9182-036-48975583-2010), 4 - 6 прессованные (ООО «САФ-НЕВА» ТУ 9182-038-48975583-2010; 4 - г.Воронеж, 5 - г.Курган, 6 - г.Узловая). На рис.2 видно, что все образцы лизировались и в водной фазе присутствует как РНК так и ДНК (верхняя полоска). Фракционирование и очистка нуклеиновых кислот. Получив экстракт клеток, добавляли к раствору SDS до конечной концентрации 2,5% и выдерживали 60-90 мин при 00С (во льду). Выпавший в осадок комплекс SDS с денатурированными белками удаляли центрифугированием (8000g - 20 мин при 00С). Исследования по фракционированию нуклеиновых кислот проводили, добавляя к образцам полученного экстракта растворы LiCl или NaCl. После внесения соли суспензии выдерживали 3-4 ч при 4-6 0С и осадки отделяли центрифугированием (8000g - 20 мин), растворяли их в небольших объемах воды и анализировали электрофорезом в геле агарозы (рис.3). Рис. 3. Электрофореграмма (1,5%-ный гель агарозы) образцов из растворов осадков, полученных после внесения в экстракт LiCl до концентраций: 1 - 2,5 М; 2 - 4 М; 3 - 5М. М - ДНК-маркеры 1 Kb «СибЭнзим». На рис.3 видно, что в осадке, полученном при концентрации LiCl 2,5 М присутствует в основном «низкомолекулярная» РНК (тРНК), тогда как в осадках, полученных при концентрациях LiCl 4 и 5 М наблюдаются фрагменты высокомолекулярных двуцепочечных нуклеиновых кислот. Причем, в последнем варианте верхняя полоса по своим размерам приближается к дрожжевой ДНК. Она хорошо визуализируется в 1%-ном геле агарозы (рис.1). При использовании для фракционирования осаждением в растворах NaCl результаты получались аналогичные. Для получения препарата суммарной РНК для осаждения была выбрана концентрация соли 3,5 М. Основной пул примесных белков при этом оставался в растворе [5] и удалялся при промывках. Полученный высаливанием 3,5 М NaCl, осадок дважды промывали 3,5 М раствором соли и растворяли в воде. Раствор осветляли центрифугированием (8000g - 20 мин при 40С) и пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего РНК осаждали, добавляя этанол до концентрации 60%. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием (8000g - 20 мин при 40С), промывали 60%-ным этанолом и лиофильно высушивали. Выход препарата РНК составлял 150 -200 мг из 100 г прессованных дрожжей. Для сравнения был проведен ряд экспериментов по очистке РНК из лизата клеток дрожжей, полученного с прогреванием суспензии 10-40 мин при 80-90 0С как предложено в работах [2-4]. Результаты представлены на рис.4. Рис. 4. Электрофореграмма (1,5%-ный гель агарозы) очищенных образцов растворов после лизиса клеток при разных температурных режимах: 1 - 80°С, 2 - 25°С. М - ДНК-маркеры 1 Kb «СибЭнзим». Как видно на рис. 4 основной пул препарата, полученный лизисом клеток при 25°С имеет более высокомолекулярную и более компактную форму (дорожка 2) в отличие от гетерогенного пула РНК, полученной лизисом при нагревании (дорожка 1). Кроме того, в препарате, полученном при низкотемпературном режиме лизиса, наблюдаются полосы двуцепочечных нуклеиновых кислот в районах 1500 и 3200 пар оснований (рис.5), которые отсутствуют в препарате, полученном с термообработкой. Рис. 5. Электрофореграмма (1%-ный гель агарозы) образцов L- и M-форм: 1 - очищенного препарата РНК, 2 - препарата из клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, М - ДНК-маркеры 1 Kb «СибЭнзим». Вероятно, на электрофореграмме видны L- и M-формы двуспиральных РНК. Этот феномен широко распространен среди культурных, в основном, винных штаммов Saccharomyces cerevisia [7]. L-форма отвечает за образование белковых капсул, в которых находятся отдельно M- и L-формы дсРНК, M-форма - за синтез токсина и устойчивость к нему. В нашем случае, фенотипический анализ показал, что обнаруженная М-форма дсРНК не функциональна и, возможно, является мутантной формой киллерных плазмид, что так же распространено [7], хотя по своим размерам она близка к М-форме киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448 (рис.5). Таким образом, лизис клеток дрожжей без термообработки позволяет выявлять штаммы, содержащие двуспиральные РНК и получать из них более выкокомолекулярные препараты РНК, в том числе - содержащие дсРНК (индуктор синтеза интерферонов). Предложенный метод получения РНК из пекарских дрожжей перспективен для создания интерферон индуцирующих (противовирусных) препаратов.

Научные конференции

 

(c) Архив публикаций научного журнала. Полное или частичное копирование материалов сайта возможно только с письменного разрешения администрации, а также с указанием прямой активной ссылки на источник.