ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА ПРИ ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ ПО ПРОГРАММЕ R-FC Чуксина Ю.Ю.,Шевелев С. В.,Инюткина Н.В.,Яздовский В.В.,Катаева Е.В.,Голенков А.К.

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского


Номер: 9-
Год: 2014
Страницы: 349-354
Журнал: Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук

Ключевые слова

В-клеточный хронический лимфолейкоз, проточная цитометрия, лимфоциты периферической крови, таргетная терапия, chronic lymphocytic leukemia, flow cytometry, peripheral blood lymphocytes, targeted therapy

Просмотр статьи

⛔️ (обновите страницу, если статья не отобразилась)

Аннотация к статье

В статье представлены исследования иммунофенотипических характеристик клеток опухолевого клона и основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом в динамике проводимой иммунохимиотерапии с применением инновационных препаратов моноклональных антител. Высокая эффективность таргетной терапии хронического лимфолейкоза, в частности, программы R-FC (Ритуксимаб, Флюдарабин, Циклофосфан) доказана фактами увеличения показателей общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования. Проведено иммунофенотипическое исследование лимфоцитов периферической крови (ПК) 60 пациентов хроническим лимфолейкозом в динамике терапии R-FC методом 4-цветной проточной цитометрии по В-, Т-, NK-клеточным антигенам и маркерам их активации (СD3, CD4, CD8, CD19, CD16, CD56, CD25, HLA-DR, CD95, CD62L, CD127, СD294), оценено содержание Т-регуляторных, Т-хелперных лимфоцитов 2 типа (ТН-2), соотношение наивных (CD4+/CD45RA+) и Т-клеток памяти (CD4+/CD45RO+). Иммунофенотипические характеристики лимфоцитов периферической крови сопоставлены с параметрами клинико-гематологической эффективности проводимой терапии и выработаны иммунологические прогностические критерии ремиссии, прогрессирования или рецидива заболевания у больных ХЛЛ.

Текст научной статьи

Введение. В-клеточный хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) развивается при накоплении медленно пролиферирующих, долгоживущих, CD5+В-клеток с дефектами апоптоза и характеризуется разнообразием клинической картины. Фенотип клеток ХЛЛ определен как CD5+/CD19+/CD23+, уровень экспрессии СD20 и СD79b снижен относительно нормы [5, 65]. Для мониторинга в настоящее время используются либо морфологические методы, интерпретация которых весьма субъективна, либо набор маркеров, как классических цитогенетических (del 17p13, del 11q22 и др.), так и связанных с анализом первичной последовательности ДНК (мутационный статус вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов IgVн), а также суррогатных маркеров (экспрессия CD38 и ZAP-70). В литературе приводятся результаты обследования ранее не леченных или больных c рецидивирующим/рефрактерным ХЛЛ, ZAP-70- и CD38-позитивность которых были связаны с более короткой средней выживаемостью без прогрессирования (ВБП) [7, 97; 12, 4968; 13, 2749]. Эти данные свидетельствуют о том, что молекулярные и цитогенетические прогностические маркеры могут использоваться для выбора лечения в зависимости от определяемых рисков. При данном подходе пациенты с заболеванием низкого риска могут подвергаться терапии хорошо переносимыми комбинациями препаратов, в то время как пациенты с неблагоприятным прогнозом могут получать более интенсивную терапию. Высокая эффективность иммунохимиотерапии в лечении больных хроническим лимфолейкозом препаратами на основе моноклональных антител (МАТ) в различных сочетаниях подтверждена множеством протоколов клинических испытаний. Программа R-FC (Ритуксимаб, Флюдарабин, Циклофосфан) доказана фактами значительного увеличения беспрогрессивной и общей выживаемости пациентов, особенно с рецидивирующим и рефрактерным характером течения заболевания. (7,97; 15, 4085]. Одним из иммунотерапевтических препаратов на основе МАТ является ритуксимаб - химерное человеческое / мышиное моноклональное антитело к антигену СD20 [3,530]. CD20 антиген экспрессируется на поверхности клеток-предшественников и зрелых В-клеток, но, что особенно важно, не на стволовых клетках [1,1429; 11, 138]. Это дает возможность пулу В-клеток после терапии ритуксимабом восстанавливаться за счет нормального гемопоэза. Механизм действия ритуксимаба включает в себя комплемент-зависимый лизис клеток, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность и непосредственную гибель клеток при связывании с антителом (апоптоз). Однако, такие факторы, как низкая плотность рецепторов СD20 на поверхности клеток ХЛЛ по сравнению с нормальными В-клетками и клетками неходжкинской лимфомы, а также наличие растворимых СD20 - молекул в плазме пациентов с ХЛЛ могут препятствовать способности ритуксимаба связываться с клетками ХЛЛ in vivo и потому снижать его эффективность по отношению к определенным типам опухолей [10, 489]. Было установлено, что пациенты, страдающие ХЛЛ с делециями хромосомы 17р более устойчивы к химиотерапии (включая и флюдарабин) и более устойчивы к ритуксимаб-индуцированному апоптозу. Потеря супрессора опухоли р53 считается механизмом, лежащим в основе недостаточного ответа у данных пациентов [4, 37]. Ритуксимаб не воздействует на Т - клетки, и уровень иммуноглобулинов в плазме остается стабильным. Как следствие, при терапии ритуксимабом редко встречаются оппортунистические инфекции [8, 470]. Несмотря на достигнутые успехи, поиск иммунологических критериев течения и прогноза заболевания при терапии ХЛЛ, остается актуальным. Ключевую роль в элиминации неопластических клеток играет специфический (адаптивный) клеточный иммунитет, реализуемый Т-лимфоцитами и неспецифический (врожденный) иммунитет, реализуемый NK-клетками и макрофагами. Нередко при лечении встречаются инфекционные, вирусные или аутоиммунные осложнения, также связанные с недостаточностью адаптивного Т-клеточного иммунитета, регулирующего большинство иммунологических реакций макроорганизма. В настоящее время фенотипические и функциональные особенности Т-лимфоцитов у больных ХЛЛ изучены недостаточно. Цель: выявление взаимосвязи между изменением фенотипических характеристик циркулирующих лимфоцитов, отражающих их функциональную гетерогенность (Т-регуляторные клетки, субпопуляции Т-хелперных лимфоцитов, В-лимфоциты, NK-клетки) и клинической эффективностью программы R-FC у первичных и резистентных больных хроническим лимфолейкозом. Материалы и методы: Обследовано 60 больных ХЛЛ, ранее не леченных или резистентных к предшествующим курсам химиотерапии. У 50% пациентов выявлена 2 стадия заболевания, у 50% пациентов - 3 и 4 стадии. Пациенты были обследованы до начала лечения, в процессе и после проведения 6 курсов терапии R-FC. Кратность иммунофенотипических исследований составила от 2 до 7. Клиническую эффективность лечения больных ХЛЛ оценивали по критериям NCI-WG (1996) как полную ремиссию (ПР), частичную ремиссию (ЧР), стабилизацию (СБ) и прогрессирование болезни (ПБ). Иммунофенотипическая диагностика минимальной остаточной болезни (МОБ) проводилась методом 4-цветной проточной цитометрии по стандартизированному европейско-американскому протоколу [14, 956]. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом 4-цветной проточной цитометрии (“Becton Dickinson”, США) по В-, Т-, NK-клеточным антигенам и маркерам их активации. Оценивалась экспрессия CD25, HLA-DR, CD95, CD62L на Т- и В-лимфоцитах, определялось содержание циркулирующих Т-регуляторных клеток (CD4+/CD25hi+/CD127-), Т-хелперных лимфоцитов 2 типа (CD4+/СD294+), соотношение наивных Т-хелперных лимфоцитов (CD4+/CD45RA+) и Т-клеток памяти (CD4+/CD45RO+). Выраженность экспрессии антигенов оценивалась по параметру средней интенсивности флюоресценции (MFI). Результаты. В исследуемой группе преобладали больные с рецидивирующим и/или рефрактерным течением заболевания ( 69%), ранее не леченные пациенты составили 31%. Таблица 1 Число пациентов ХЛЛ, позитивных по CD38- и CD25-антигенам на клетках В-ХЛЛ Показатель / Доля пациентов (%) Дебют / n= 21 Рецидив / n= 39 % от всех пациентов n=60 СD38+/CD19+> 20% 44% 31% 40% CD25+/CD19+> 20% 37% 92% 55% Иммунофенотипически выявлено 40% пациентов, позитивных по экспрессии CD38-антигена на клетках В-ХЛЛ (более 20% позитивных клеток). Экспрессия CD38-антигена на В-лимфоцитах более 20% позитивных клеток свидетельствует об отсутствии соматических гипермутаций вариабельных участков генов иммуноглобулинов и коррелирует со снижением общей выживаемости пациентов ХЛЛ [16, 47]. Оценивали уровень экспрессии CD38 в зависимости от ответа на лечение (Таблица №2). Таблица 2 Зависимость эффекта терапии RFC от значения CD38+ клеток у больных ХЛЛ CD38+ менее 20%, п=34 CD38+ более 20%, п=26 До лечения CD38+:3,98+-0,3% (0,1-18%) До лечения CD38+:36,97+-0,64% (20-88%) Число пациентов ПР (п=17) ЧР (п=10) СБ (п=2) ПБ (п=0) ПБ (п= 3) ПР (n=11) ЧР (n=8) СБ (n=4) 58,6% 34,5% 6,9% 0% 11,5% 42,3% 30,8% 15,4% После лечения: CD38+: 0,52+-0,04% (0-3,5) CD38+: 4,78+-0,09% (0-18,7) Больные были разделены на 2 группы: 1 - я группа - пациенты, у которых уровень CD38+клеток до проведения программы RFC был ниже 20% (0,1-18%), в среднем 3,98+-0,3%, во 2-ой группе уровень CD38+клеток был выше 20% (20-88%), в среднем 36,97+-0,64%. В группе пациентов CD38-негативных число ответивших пациентов было значительно выше (93%), чем в группе CD38-позитивных пациентов (73%) . Количество CD38-позитивных клеток достоверно снижалось в обеих группах пациентов и составило 0,52+-0,04% и 4,78+-0,09% соответственно. Нами установлено, что в дебюте заболевания содержание CD25-позитивных В-клеток (R-ИЛ-2) варьировало от 0,06 до 76% [17,78]. Содержание CD25+/CD19+клеток более 30% от популяции клеток В-ХЛЛ отмечено у 37% пациентов в дебюте заболевания и у 92% пациентов, вышедших в рецидив после предшествующих курсов терапии. По данным литературы, экспрессия CD25 на В-лимфоцитах отражает не только раннюю активацию этих клеток, но и их пролиферативный потенциал [9,7; 18, 453]. Роль экспрессии рецептора ИЛ-2 на В-лимфоцитах в патогенезе ХЛЛ изучена недостаточно. Выявлена положительная корреляция между уровнем CD25+/CD19+клеток и эффективностью лечения пациентов данной группы. Данные по сопоставлению фенотипических характеристик В-лимфоцитов периферической крови у пациентов ХЛЛ с показателями клинической эффективности терапии R-FC представлены в таблице 3. Таблица 3 Фенотипическая характеристика В-лимфоцитов ПК у больных ХЛЛ в процессе терапии R-FC Показатель (% ) До лечения Стабилизация Болезни 3-4 курса Частичная Ремиссия 2-8 курсов Полная Ремиссия 4-6 курсов Прогрессирова-ние болезни 1-7 курсов Число пациентов n=60 n=7 n=15 n=31 n=7 CD19+ 90,2+-4,8 43,7+-10,8 24,7+-9,2* 1,5+-0,6* 86,5+-7,5 CD 20+ 76,5+-7,9 dim 25,8+-15,6* dim / mod 8,8+-5,6* dim / mod 0,75+-0,08* 44,2+-9,6dim СD5+/CD19+ 73, 5+-3,7 51,6+-12,9 16,9+-5,5* 0,5+-0,1* 58,9+-11,8 CD23+/CD19+ 60,5+-3,5 33,4+-8,0 10,7+-4,4 0,05+-0,02 39,0+-6,8 CD38+/CD19+ 37,4+-4,2 6,9+-3,2 0,94+-0,3 0,17+-0,07 2,5+-1,1 CD25+/CD19+ 26,0+-4,4* 27,8+-15,3 11,5+-4,14* 0,73+-0,13* 42,6+-8,8* Рестрикция по Kappa-/Lambdaлегким цепям иммуноглобулинов У 100% пациентов У 100% пациентов У 46% пациентов У 12% пациентов У 100% пациентов Примечания: * - статистически значимые различия между группами ( р<0,05) До начала терапии высокое содержание CD20+ лимфоцитов ПК установлено у 59 (99%) пациентов в диапазоне от 50 до 96% позитивных клеток со слабой (dim) интенсивностью флюоресценции. При сопоставлении иммунологических показателей с критериями клинической эффективности лечения пациентов было выявлено, что при стабилизации заболевания и в процессе достижения частичной ремиссии у пациентов на фоне снижения уровня В-клеток и постепенной элиминации опухолевого клона (CD5+/CD23+/CD19+) отмечалась нормализация содержания CD20+лимфоцитов, а цитометрически детектировалось появление 2-го клона клеток с промежуточной (mod) или яркой (bright) экспрессией антигенов CD20+, определяемой по параметру MFI, что свидетельствовало о постепенном замещении клеток В-ХЛЛ на В-лимфоциты с «нормальной» мембранной экспрессией этого маркера. Впоследствии была установлена корреляция с достижением у данных больных полной клинико-гематологической ремиссии. При прогрессировании болезни интенсивность экспрессии CD20+ оставалась слабой (dim). Группа пациентов с ЧР оказалась неоднородной: у 45% пациентов была отмечена практически элиминация опухолевого клона из ПК после 4 - 6 курсов R-FC, у других 55% пациентов сохранялся клон клеток ХЛЛ в среднем на уровне 37,8±6,8%. Клинико-гематологическая полная ремиссия была достигнута к 5-6 курсам терапии у 31 пациента, из них иммунофенотипическая (МОБ-отрицательная) ремиссия - у 22% пациентов. При достижении пациентами ПР на фоне элиминации опухолевого клона выявлено достоверное снижение содержания CD25+B-лимфоцитов до 0,73+-0,13%, в то время, как при ПБ отмечено существенное увеличение этого показателя (46,8+-5,4%) по сравнению с исходным уровнем (23,5+-6,5%). Ритуксимаб-содержащие режимы терапии быстро снижают количество как злокачественных, так и нормальных CD20+В-клеток в периферической крови и их число обычно остается низким или не определяется вообще в течение 2-6 месяцев (87+). По нашим данным, восстановление нормального содержания В-лимфоцитов ПК после достижения ПР происходило в среднем к 8,6 месяцам. Нами проведен анализ фенотипических характеристик Т- и NK-лимфоцитов, отражающих их функциональную гетерогенность у больных ХЛЛ в процессе терапии. До начала терапии у больных ХЛЛ выявлено выраженное увеличение абсолютного числа Т-лимфоцитов (5046,7+-846,3) за счет Т-цитотоксической (2434,7+-471,1), но не Т-хелперной субпопуляции (1995,6+-325), снижение содержания NKT-лимфоцитов (1,28+-0,27%) по сравнению с нормальными показателями (5,0+-1,2%). В результате лечения при достижении ЧР и ПР отмечено восстановление до нормы абсолютного числа CD3+лимфоцитов, CD3+CD8+, NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) и NKT-лимфоцитов (CD3+CD16+56+) только у 50% пациентов. Даже при достижении ПР у 75% пациентов сохранялось выраженное снижение абсолютного количества CD3+CD4+лимфоцитов (391,1+-0,06) по сравнению с нормальными показателями (895+-0,23). При ПБ выявлено усугубление дисбаланса в содержании цитотоксической (CD3+/CD8+) и хелперной (CD3+/CD4+) субпопуляций Т-лимфоцитов, рост числа NK-клеток. Содержание Т-регуляторных клеток (CD4+/CD25hi+CD127-) до лечения было снижено (1,9+-0,5%) по сравнению с нормой (3,7+-2,1%), при достижении ПР отмечалось их увеличение до 4,8+-1,4%, что сопровождалось и увеличением активированных Т-лимфоцитов: CD3+HLA-DR+ (30,8+-6,7% при норме 6,3+-0,7%), CD3+CD95+ (65,9+-5,3% при норме 44,6+-7,8%), выраженным преобладанием Т-лимфоцитов памяти (CD4+/CD45RO+) (36,7+-3,4%) над наивными Т-лимфоцитами (CD4+/CD45RA+) (2,1+-0,6%), причем последние были снижены по сравнению с нормой (32,7+-5,2%) примерно в 20 раз. Содержание CD3+CD62L+лимфоцитов было снижено у пациентов ХЛЛ при ПР (33,1+-2,5%) по сравнению с нормальными значениями (64,98+-3,8%). Уровень Т-хелперных лимфоцитов 2 типа (CD4+/СD294+) в пределах CD3+клеток у больных ХЛЛ при достижении ПР составил 5,6+-1,3%, что достоверно не отличалось от нормы. Популяция CD4+/CD25hi+ Т-клеток человека гетерогенна по функциональным свойствам и фенотипическим признакам. Она включает в себя популяции пролиферирующих CD4+/CD45RO+/CD45RA+ CD25lowТ-клеток и «регуляторных» CD4+CD45RO+CD25hi Т-лимфоцитов. Идентификацию этих клеток принято проводить по совокупности параметров экспрессии молекул CD38, CD62L, CD95, HLA-DR [2,1245; 6,343]. Выраженное снижение абсолютного содержания Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов при ПР происходит за счет наивных Т-лимфоцитов (CD4+/CD45RA+ и CD3+CD62L+). Усугубление дисбаланса в содержании цитотоксической и хелперной субпопуляций Т-лимфоцитов, рост числа NK-клеток может свидетельствовать о ПБ. Выраженная активация Т-лимфоцитов по экспрессии HLA-DR- и CD95-антигенов отражает интенсивность антигенной нагрузки и повышенную готовность к апоптозу. Заключение. 1. Цитометрическая оценка интенсивности экспрессии (MFI) антигена CD20 в процессе терапии может служить прогностическим фактором стабилизации или ремиссии заболевания (постепенного замещения пула опухолевых клеток на В-лимфоциты с нормальной мембранной экспрессией этого маркера). 2. Определен дополнительный иммунологический фактор неблагоприятного прогноза течения заболевания: увеличение экспрессии антигена CD25 на В-клетках может быть показателем прогрессирования и рецидива заболевания у пациентов ХЛЛ. 3. Выявлено выраженное увеличение абсолютного числа Т-лимфоцитов за счет цитотоксической субпопуляции и резкое снижение уровня Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов до начала терапии, который не восстанавливался до нормы даже при достижении полной ремиссии заболевания у 75% пациентов. 4. Обнаружено снижение уровня активированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (в том числе, Т-регуляторных клеток CD3/CD4/CD25+hiСD127-) у больных В-ХЛЛ по сравнению со здоровыми лицами. 4. Показателем прогрессирования заболевания служит усугубление дисбаланса в содержании цитотоксической (CD3+/CD8+) и хелперной (CD3+/CD4+) субпопуляций Т-лимфоцитов, рост количества NK-клеток. 5. Показателем достижения ремиссии заболевания служит выраженное увеличение экспрессии HLA-DR+ антигена на Т-лимфоцитах.

Научные конференции

 

(c) Архив публикаций научного журнала. Полное или частичное копирование материалов сайта возможно только с письменного разрешения администрации, а также с указанием прямой активной ссылки на источник.