РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБЩЕЙ ТОКСИЧНОСТИ ДНКАЗЫ СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА Сон О.М.,Подволоцкая А.Б.,Балабанова Л.А.,Филь Д.А.

Дальневосточный федеральный университет


Номер: 12-6
Год: 2015
Страницы: 5-7
Журнал: Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук

Ключевые слова

ДНКаза, рекомбинантные ферменты, токсичность, биотестирование, DNase, recombinant enzymes, toxicity bioassay

Просмотр статьи

⛔️ (обновите страницу, если статья не отобразилась)

Аннотация к статье

Представлены результаты изучения общей токсичности «ДНКазы» спермиев морского ежа S.intermedius. Установлено, что дозировка рекомбинантного фермента в диапазоне концентраций 20-40 мкг/мл не оказывает токсического действия на развитие клеток Scenedesmus quadricauda.

Текст научной статьи

Причина интереса исследователей к ферментам типа нуклеаз, связана с их возможным использованием в качестве новых катализаторов для различных биотехнологических процессов. В этом случае интерес к ферментам морского происхождения определяется возможными преимуществами, которые они должны иметь в сравнении с ранее известными ферментами: наличие у ферментов уникальных свойств и специфичности, их более выраженная устойчивость к действию таких внешних факторов как температура и соленость среды. Признано, что одним из важных условий практического применения данных ферментов является их доступность и низкая стоимость исходного источника для их получения. С этой точки зрения морские организмы являются одним из весьма перспективных источников для производства ферментов - они легко воспроизводятся методами марикультуры. Кроме того, использование отходов марикультуры и рыбной промышленности для производства ценных субстратов нуклеаз, таких как ДНК и РНК, может дать значительную экономическую выгоду для обоих видов индустриальных производств. Предпосылкой данной работы стало открытие способности морских организмов продуцировать различного типа нуклеазы, рибонуклеазы и новые высокоспецифичные ДНКазы, так называемые "рестрикционные” эндонуклеазы. [1]. В настоящее время, с активным развитием биотехнологических процессов, использование рекомбинантных ферментов в пищевой и перерабатывающей промышленности стало актуальным и востребованным. Однако, немаловажным остается изучение вопроса токсичности новых разрабатываемых и тестируемых веществ. Поэтому, целью исследования явилось изучение изменения свойств культуральной среды в процессе роста водорослей Scenedesmus quadricauda в присутствии рекомбинантных ферментов морских организмов (ДНКазы спермиев морского ежа). В качестве методики исследования был выбран метод определения токсичности по ГОСТ Р 54496-2011 «Вода. Определение токсичности с использованием зеленых пресноводных одноклеточных водорослей». Сущность метода заключается в регистрации изменения плотности (численности) клеток зеленых пресноводных одноклеточных водорослей в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч при переменном воздействии света и при постоянной температуре. В качестве «токсиканта» тестировалось ДНКаза спермиев морского ежа. Рекомбинантный фермент в концентрациях 20, 40, 60 мкг/мл добавляли в культуры однократно в момент постановки эксперимента. Методика определения токсичности на культуре зеленых протококковых водорослей (Scenedesmus quadricauda (Turpin) Brebisson, 1835) основана на регистрации темпа роста (снижения численности) клеток водорослей под воздействием «модельных токсических веществ» (опыт) по сравнению с контрольной культурой в пробах, не содержащих «токсических веществ» (контроль). Устанавливалась острая токсичность или эффективная кратность разбавления 72чЭКР50 водных вытяжек, вызывающая снижение численности клеток водорослей на 50 % и более по сравнению с контролем за 72 часа экспозиции. Об угнетении водорослей в опыте по сравнению с контролем судили по снижению численности клеток водорослей через 72 часа от начала биотестирования. Для биотестирования использовали альгологически чистую культуру водорослей Scenedesmus quadricauda, находящуюся в экспоненциальной стадии роста (3-5 суток после пересева). В стеклянные плоскодонные колбы вместимостью 250 см3 наливали по 100 см3 контрольной (дистиллированной воды с рН 7.0-7.5) и исследуемой жидкости. Повторность двукратная. Затем в каждую колбу пипеткой стерильно, над пламенем горелки добавляли по 0.1 см3 раствора реактивов, согласно ГОСТ Р 54496-2011. Содержимое колб перемешивали. Затем во все колбы добавляли равные объемы суспензии водорослей, с учетом того, чтобы численность клеток в них составила 2,0 - 3,0 * 104 кл./л. После внесения водорослей колбы вновь перемешивали. Затем производили подсчет клеток водорослей в камере Горяева во всех контрольных и испытуемых пробах. В каждой колбе дважды подсчитывали численность клеток. Содержимое колб вновь перемешивали, закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками и устанавливали в люминостат при температуре от +22°С до +25°С, освещенности 3000-10000 Лк, световой период - 24 часа. Клетки водорослей поддерживали во взвешенном состоянии в колбах путем встряхивания 1-2 раза в сутки, чтобы улучшить газообмен и сократить колебания водородного показателя за счет выделяющегося углекислого газа водорослями в исследуемых растворах. Через 72 часа от начала биотестирования проводили подсчет численности клеток в камере Горяева в контрольных и опытных колбах. Численность водорослей в контроле увеличивалась не менее чем в 10 раз за 72 часа экспозиции. Изменение рН в конце эксперимента составляло не более 1,0. При определении острого токсического действия для каждого разведения по результатам трех параллельных определений вычисляли среднее значение численности клеток. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1. Характеристика степени токсичности испытуемого раствора Средняя плотность (численность) клеток водорослей n*104 клеток/см3, подсчитанная после тестирования (72 ч) Массовая концентрация раствора модельного токсиканта, мкг/мл 0 (Контроль) 20 40 60 начало окончание начало окончание начало окончание начало окончание 27,0 35,0 27,0 29,66 27,0 26,7 27,0 25,4 29,0 31,0 29,0 31 29,0 29,6 29,0 24,0 31,0 37,0 31,0 34,5 31,0 29,8 31,0 23,2 Кратность-11,83 Кратность-10,94 Кратность-9,9 Кратность-8,3 Биотестирование рекомбинантного фермента, полученного из спермиев морского ежа - «ДНКаза» на тест-объекте - Scenedesmus quadricauda показало, что токсическое действие испытуемого вещества увеличивается с возрастанием концентрации в среде; в концентрации 20 мкг/мл водная вытяжка не оказывает токсического действия на тест-объекты. Численность водорослей при концентрации 60 мкг/мл снижалась в 3,53 раза по сравнению с контролем. Таким образом, выбранная дозировка рекомбинантного фермента в диапазоне концентраций 20-40 мкг/мл не оказывает токсического действия на развитие клеток Scenedesmus quadricauda.

Научные конференции

 

(c) Архив публикаций научного журнала. Полное или частичное копирование материалов сайта возможно только с письменного разрешения администрации, а также с указанием прямой активной ссылки на источник.